hCov-NL63最早是在2004年初在荷蘭從一個(gè)7個(gè)月大的嬰兒中從吸出物中分離出來(lái)的。此后，HCoV-NL63的感染已被證明是世界范圍內(nèi)普遍存在的疾病，并與許多臨床癥狀有關(guān)。診斷包括嚴(yán)重的下呼吸道感染，臀部炎和細(xì)支氣管炎。HCoV-NL63引起兒童疾病，老年人和免疫功能低下的兒童，在兒童呼吸道感染中占1.0-9.3％。

根據(jù)CDC和WHO的介紹，針對(duì)HCoV-NL63的核酸診斷一般是針對(duì)RdRP (RNA-dependent RNA polymerase)、Gene N和Gene E， Gene S更多用于對(duì)應(yīng)藥物和疫苗的開(kāi)發(fā)。NCBI收錄序列為JX504050.1，全長(zhǎng)27553bp，基因編碼4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白：S，M，N和E。

以往針對(duì)試劑盒檢測(cè)限的性能評(píng)價(jià)，一般是選擇體外轉(zhuǎn)錄的RNA、或者臨床陽(yáng)性病毒來(lái)作為標(biāo)準(zhǔn)品，用于性能評(píng)價(jià)。但是兩者都具有很明顯的確定，首先體外轉(zhuǎn)錄的RNA，一般是很純，單一，不涉及提取，不符合臨床病毒的微環(huán)境，因此必然造成檢測(cè)靈敏度被高估，這也是存在高概率假陰性的主要原因；再次臨床陽(yáng)性病毒，即使是滅活的病毒，也是存在很大的生物安全隱患，因此要求實(shí)驗(yàn)室級(jí)別為P3-P4，大部分開(kāi)發(fā)診斷試劑盒單位都不滿足改要求，另外臨床陽(yáng)性病毒也是來(lái)源很有限，不能被穩(wěn)定供應(yīng)，反復(fù)用于試劑盒的性能評(píng)價(jià)。

有病毒的完整包膜結(jié)構(gòu)，有HCoV-NL63對(duì)應(yīng)的核酸序列，但是生物安全風(fēng)險(xiǎn)較低的假病毒標(biāo)準(zhǔn)品，完美的克服了選擇體外轉(zhuǎn)錄的RNA、或者臨床陽(yáng)性病毒來(lái)作為標(biāo)準(zhǔn)品的缺點(diǎn)，非常適合用于核酸診斷性能評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)品。

構(gòu)建過(guò)程：HCoV-NL63基因合成→假病毒包裝→純化→QC檢測(cè)（ddPCR）

Gene E（234bp）

• 根據(jù)HCoV-NL63冠狀病毒的特點(diǎn)，選取了ORF1ab/RdRP（RNA-dependent RNA polymerase）、Gene E(envelope protein)、Gene N(nucleocapsid phosphoprotein)合計(jì)3個(gè)區(qū)段的序列，用于假病毒的包裝，3個(gè)區(qū)段很好的表征了HCoV-NL63的特征序列；

• 科佰生物設(shè)計(jì)了ddPCR體系的引物、探針序列，可不需要構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線的前提下完成對(duì)假病毒的QC拷貝數(shù)檢測(cè)，非常準(zhǔn)確表征標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)，而且克服了Q-PCR分析CT值的相對(duì)判斷標(biāo)準(zhǔn)的不準(zhǔn)確性；

• 假病毒標(biāo)準(zhǔn)品，無(wú)致病性，可再生，質(zhì)控方法可靠，批次間穩(wěn)定，可以長(zhǎng)期穩(wěn)定制備和供應(yīng)，而且要求實(shí)驗(yàn)室生物安全級(jí)別為P2，滿足很多單位的安全需求。

Gene E:

ATGTTCCTTCGATTAATTGATGACAATGGTATTGTCCTCAATTCCATTTTATGGCTCCTTGTTATGATATTTTTCTTTGTGTTGGCAATGACCTTTATTAAACTGATTCAATTGTGTTTTACT

TGTCATTATTTTTTTAGTAGGACATTATATCAACCAGTTTATAAAATTTTTCTTGCTTACCAAGATTATATGCAAATAGCACCTGTTCCAGCTGAAGTACTAAATGTCTAA