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dPCR檢測(cè)

產(chǎn)品描述
周期報(bào)價(jià)
案例展示

服務(wù)原理

研究PCR技術(shù)從1983年開(kāi)始依次經(jīng)歷普通PCR,Real-Time PCR和dPCR,現(xiàn)如今dPCR技術(shù)的發(fā)展就像1990年代末的Real-Time PCR發(fā)展一樣,發(fā)展迅猛。
下面我們以DdPCR為例,討論dPCR技術(shù)。

什么是DdPCR? 有什么技術(shù)特征?有哪些方面的應(yīng)用?
DdPCR全稱Droplet Digital PCR,引用bio-rad的描述為Droplet Digital PCR technology is a digital PCR method utilizing a water-oil emulsion droplet system. Droplets are formed in a water-oil emulsion to form the partitions that separate the template DNA molecules. The droplets serve essentially the same function as individual test tubes or wells in a plate in which the PCR reaction takes place, albeit in a much smaller format. The massive sample partitioning is a key aspect of the ddPCR technique.



從基本原理我們不難看出,DdPCR最大的優(yōu)點(diǎn)是絕對(duì)定量,表現(xiàn)為:

· 絕對(duì)定量 -ddPCR技術(shù)無(wú)需輸入標(biāo)準(zhǔn)曲線即可提供每個(gè)輸入樣品的目標(biāo)DNA拷貝的絕對(duì)計(jì)數(shù),使該技術(shù)非常適合目標(biāo)DNA的測(cè)量,病毒載量分析和微生物定量;
· 較高的精確度 – ddPCR提供的大量樣品分配功能可以可靠地測(cè)量樣品中靶DNA序列拷貝數(shù)的微小差異;
· 提高信噪比 -稀釋高拷貝模板和背景,有效富集靶標(biāo)陽(yáng)性分區(qū)中的模板濃度,從而可以靈敏地檢測(cè)稀有靶標(biāo),并實(shí)現(xiàn)±10%的定量精度,靈敏度可達(dá)單個(gè)核酸分子,檢測(cè)限低至0.001%;
· 消除PCR偏差 -消除qPCR的擴(kuò)增效率依賴性,降低了錯(cuò)誤率,可檢測(cè)到小的(1.2倍)差異,這里需要指出的是;
· 降低了耗材成本 -反應(yīng)體積在皮升至納升的范圍內(nèi),減少了試劑的使用和每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)所需的樣品量,對(duì)于珍貴的樣品尤其適用;
· 降低設(shè)備成本 -基于乳液的反應(yīng)系統(tǒng)意味著PCR反應(yīng)可以在標(biāo)準(zhǔn)的熱循環(huán)儀中進(jìn)行,而無(wú)需復(fù)雜的芯片或微流體。
· 出色的分區(qū) -ddPCR技術(shù)每20 µl樣品可產(chǎn)生20,000個(gè)液滴,在96孔板上可進(jìn)行近200萬(wàn)個(gè)分區(qū)PCR反應(yīng),分區(qū)數(shù)量越多,精度越高。

服務(wù)應(yīng)用

DdPCR技術(shù)有很多方面的應(yīng)用,我們按照發(fā)表文章的領(lǐng)域,可以簡(jiǎn)單劃分為:



結(jié)合腫瘤領(lǐng)域,我們一般與之相關(guān)的有4個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用:
1. 檢測(cè)Gene Expression,主要是檢測(cè)mRNA的定量分析;
2. 檢測(cè)Mutation(SNV和Indel),可以檢測(cè)拷貝數(shù),也可以檢測(cè)比率;
3. 檢測(cè)CNV(拷貝數(shù)變異分析),相對(duì)定量;
4. 檢測(cè)Fusion,可以檢測(cè)拷貝數(shù),也可以檢測(cè)比率;

案例展示

      科佰生物針對(duì)以上應(yīng)用開(kāi)發(fā)對(duì)應(yīng)的檢測(cè)試劑盒,配套科佰生物的參考品,對(duì)試劑盒做性能評(píng)價(jià),如下我們以EGFR T790M為例:

 

 

實(shí)驗(yàn)一:LOB空白限測(cè)試

 

 

 

待測(cè)樣本:20個(gè)陰性樣本和1個(gè)NTC。分別將投入量設(shè)置為10ng和40ng,每個(gè)樣本做兩個(gè)重復(fù)進(jìn)行Bio-Rad數(shù)字PCR檢測(cè)。

 

 

由上數(shù)據(jù)可見(jiàn):無(wú)論是10ng還是40ng,LOB控制在2拷貝以內(nèi)(一般噪音拷貝為5以內(nèi)),雜點(diǎn)不呈現(xiàn)劑量的依賴,是隨機(jī)產(chǎn)生的噪音信號(hào)。

 

 

實(shí)驗(yàn)二:準(zhǔn)確性測(cè)試

 

 

 

待測(cè)樣本:10個(gè)NGS驗(yàn)證為陽(yáng)性的樣本(編號(hào)1-10);  10個(gè)NGS驗(yàn)證為陰性的樣本(編號(hào)11-20)。對(duì)20個(gè)樣本分別使用數(shù)字PCR檢測(cè)。

 

 

由上數(shù)據(jù)可見(jiàn):

①測(cè)試10個(gè)NGS陽(yáng)性樣本,檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性,陽(yáng)性符合率100%,并定量檢出變異頻率。

②測(cè)試10個(gè)NGS陰性樣本,檢測(cè)結(jié)果均為陰性,陰性符合率100%,定值變異頻率均為0%。

 

 

實(shí)驗(yàn)三:線性范圍測(cè)試

 

 

 

1、投入量與拷貝數(shù)、頻率之間的線性測(cè)試

首先選取50%突變頻率的EGFR T790M標(biāo)準(zhǔn)品(CBP10402),該標(biāo)準(zhǔn)品是通過(guò)基因編輯,二等位基因,CN=2,編輯一條為mutation,一條為WT,經(jīng)過(guò)理論值計(jì)算、Sanger測(cè)序、Bio-Rad DdPCR試劑盒(Assay ID: dHsaCP2000019)共同驗(yàn)證,確認(rèn)為50%的頻率。

 

1.1 投入量在0.1ng~200ng間設(shè)置10個(gè)梯度,進(jìn)行數(shù)字PCR檢測(cè)(2復(fù)孔),分別考量FAM拷貝數(shù)與投入量是否線性相關(guān)、VIC拷貝數(shù)與投入量是否線性相關(guān);

 

1.2 投入量在0.1ng~200ng間設(shè)置10個(gè)梯度,進(jìn)行數(shù)字PCR檢測(cè)(2復(fù)孔),判斷是否滿足%AF=50±10%波動(dòng)。

 

 

由上數(shù)據(jù)可見(jiàn):

200 ng投入量過(guò)大,拷貝數(shù)不呈現(xiàn)線性,雖然滿足45-55%范圍,但是不適合做單一通道的拷貝數(shù)判定;

0.1 ng投入量過(guò)小,拷貝數(shù)不呈現(xiàn)線性,同時(shí)42.59%也低于45%,不適合做單一通道,也不適合做雙通道;

因此:范圍為0.5-100ng。

 

2、線性稀釋不同頻率理論值與檢測(cè)值的線性測(cè)試

根據(jù)以上結(jié)論,我們選取10ng作為進(jìn)一步的%AF線性范圍探索,首先使用EGFR T790M的對(duì)應(yīng)的陰性標(biāo)準(zhǔn)品,對(duì)50%的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行有限稀釋,0.1%-50%間設(shè)置9個(gè)AF梯度,進(jìn)行數(shù)字PCR檢測(cè)(2復(fù)孔)。

 

 

由上數(shù)據(jù)可見(jiàn):在10ng的投入量下,AF%呈現(xiàn)非常好的線性稀釋,存在波動(dòng),但是都在誤差范圍內(nèi)。

 

 

實(shí)驗(yàn)四:檢測(cè)限測(cè)試

 

 

 

我們可以通過(guò)理論計(jì)算來(lái)預(yù)測(cè)下可能的檢測(cè)限范圍。當(dāng)控制拷貝在15000(對(duì)應(yīng)50ng input)以內(nèi)時(shí)LOB數(shù)據(jù)是2,2/15000=0.0133%,預(yù)測(cè)檢測(cè)限為0.0200%。

 

在如此低頻的情況下,臨床適用場(chǎng)景適合ctDNA,一般來(lái)說(shuō)臨床上10ml全血,一般中位值ctDNA是20-40ng,取最低值20ng。20ng 理論值6000個(gè)拷貝數(shù),2/6000=0.0333%,預(yù)測(cè)檢測(cè)限為0.0500%。

 

0.05%的誤差范圍是±50%,就是0.025-0.075%,因此我們選擇3個(gè)點(diǎn),探尋LOD分別為 0.010%、0.050%、0.100%,要求95%檢出。

 

0.010%  

對(duì)20個(gè)0.01%的樣本進(jìn)行數(shù)字PCR檢測(cè),觀察在0.005-0.015%以內(nèi)是否達(dá)成95%檢出。

 

0.05%  

對(duì)20個(gè)0.05%的樣本進(jìn)行數(shù)字PCR檢測(cè),觀察在0.025-0.075%以內(nèi)是否達(dá)成95%檢出。

0.1%  

對(duì)20個(gè)0.1%的樣本進(jìn)行數(shù)字PCR檢測(cè),觀察在0.05-0.15%以內(nèi)是否達(dá)成95%檢出。

 

由上數(shù)據(jù)可見(jiàn):選擇0.05%作為該檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)限LOD。

 

 

實(shí)驗(yàn)五:精密度測(cè)試

 

 

 

選取強(qiáng)陽(yáng)性2%樣本20個(gè),中陽(yáng)性1%樣本20個(gè),弱陽(yáng)性0.2%樣本20個(gè)分別進(jìn)行數(shù)字PCR檢測(cè)。

 

由上數(shù)據(jù)可見(jiàn):強(qiáng)陽(yáng)性2% 、中陽(yáng)性1% 、弱陽(yáng)性0.2%三種檢測(cè)體系下,誤差均在合理的范圍內(nèi),精密度良好。

 

 

實(shí)驗(yàn)六:回收率測(cè)試

 

 

 

首先使用EGFR T790M的對(duì)應(yīng)的陰性標(biāo)準(zhǔn)品,對(duì)50%的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行有限稀釋,每個(gè)梯度使用陰性樣本兩倍稀釋,接著對(duì)11個(gè)樣本進(jìn)行檢測(cè)。

 

由上數(shù)據(jù)可見(jiàn):當(dāng)AF在0.05%-50%范圍內(nèi),對(duì)應(yīng)的回收率在80-120%范圍,符合預(yù)期。

 

 

實(shí)驗(yàn)七:重復(fù)性測(cè)試

 

 

 

取10個(gè)不同AF(1%~50%)的標(biāo)準(zhǔn)品樣本,分別安排實(shí)驗(yàn)員A、實(shí)驗(yàn)員B在同一天,每人進(jìn)行四次檢測(cè)。

 

由上數(shù)據(jù)可見(jiàn):EGFR T790M檢測(cè)體系是穩(wěn)定可重復(fù)的檢出的。

 

 

實(shí)驗(yàn)八:重現(xiàn)性測(cè)試

 

 

 

取10個(gè)不同AF(1%~50%)的標(biāo)準(zhǔn)品樣本,分別安排①實(shí)驗(yàn)員A、實(shí)驗(yàn)員B在同一天進(jìn)行每人四次實(shí)驗(yàn)測(cè)試;②實(shí)驗(yàn)員A在第一天、第二天分別進(jìn)行四次實(shí)驗(yàn)測(cè)試;③實(shí)驗(yàn)員A在第一天進(jìn)行四次實(shí)驗(yàn)測(cè)試,實(shí)驗(yàn)員B在第二天進(jìn)行四次實(shí)驗(yàn)測(cè)試。

由上數(shù)據(jù)可見(jiàn):EGFR T790M檢測(cè)體系是穩(wěn)定可重復(fù)的在不同人、不同時(shí)間檢出,重現(xiàn)的。

 

      科佰生物已經(jīng)開(kāi)發(fā)了多款dPCR試劑盒檢測(cè)體系,并利用自身的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了性能驗(yàn)證??捎糜诨蛲蛔儯诤?,拷貝數(shù)變異等的檢測(cè)。同時(shí),我們可以提供dPCR檢測(cè)的科研服務(wù),基于其絕對(duì)定值、精準(zhǔn)定量的強(qiáng)大優(yōu)勢(shì),為客戶的樣本檢測(cè)提供優(yōu)質(zhì)服務(wù)。

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