▏ 服務(wù)原理

研究PCR技術(shù)從1983年開始依次經(jīng)歷普通PCR，Real-Time PCR和dPCR，現(xiàn)如今dPCR技術(shù)的發(fā)展就像1990年代末的Real-Time PCR發(fā)展一樣，發(fā)展迅猛。
下面我們以DdPCR為例，討論dPCR技術(shù)。

什么是DdPCR? 有什么技術(shù)特征？有哪些方面的應(yīng)用？
DdPCR全稱Droplet Digital PCR，引用bio-rad的描述為Droplet Digital PCR technology is a digital PCR method utilizing a water-oil emulsion droplet system. Droplets are formed in a water-oil emulsion to form the partitions that separate the template DNA molecules. The droplets serve essentially the same function as individual test tubes or wells in a plate in which the PCR reaction takes place, albeit in a much smaller format. The massive sample partitioning is a key aspect of the ddPCR technique.



從基本原理我們不難看出，DdPCR最大的優(yōu)點(diǎn)是絕對(duì)定量，表現(xiàn)為：

· 絕對(duì)定量 -ddPCR技術(shù)無需輸入標(biāo)準(zhǔn)曲線即可提供每個(gè)輸入樣品的目標(biāo)DNA拷貝的絕對(duì)計(jì)數(shù),使該技術(shù)非常適合目標(biāo)DNA的測(cè)量，病毒載量分析和微生物定量；
· 較高的精確度 – ddPCR提供的大量樣品分配功能可以可靠地測(cè)量樣品中靶DNA序列拷貝數(shù)的微小差異；
· 提高信噪比 -稀釋高拷貝模板和背景，有效富集靶標(biāo)陽性分區(qū)中的模板濃度，從而可以靈敏地檢測(cè)稀有靶標(biāo)，并實(shí)現(xiàn)±10％的定量精度，靈敏度可達(dá)單個(gè)核酸分子，檢測(cè)限低至0.001%；
· 消除PCR偏差 -消除qPCR的擴(kuò)增效率依賴性，降低了錯(cuò)誤率，可檢測(cè)到小的（1.2倍）差異，這里需要指出的是；
· 降低了耗材成本 -反應(yīng)體積在皮升至納升的范圍內(nèi)，減少了試劑的使用和每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)所需的樣品量，對(duì)于珍貴的樣品尤其適用；
· 降低設(shè)備成本 -基于乳液的反應(yīng)系統(tǒng)意味著PCR反應(yīng)可以在標(biāo)準(zhǔn)的熱循環(huán)儀中進(jìn)行，而無需復(fù)雜的芯片或微流體。
· 出色的分區(qū) -ddPCR技術(shù)每20 µl樣品可產(chǎn)生20,000個(gè)液滴，在96孔板上可進(jìn)行近200萬個(gè)分區(qū)PCR反應(yīng)，分區(qū)數(shù)量越多，精度越高。

▏ 服務(wù)應(yīng)用

DdPCR技術(shù)有很多方面的應(yīng)用，我們按照發(fā)表文章的領(lǐng)域，可以簡(jiǎn)單劃分為：



結(jié)合腫瘤領(lǐng)域，我們一般與之相關(guān)的有4個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用：
1. 檢測(cè)Gene Expression，主要是檢測(cè)mRNA的定量分析；
2. 檢測(cè)Mutation（SNV和Indel），可以檢測(cè)拷貝數(shù)，也可以檢測(cè)比率；
3. 檢測(cè)CNV（拷貝數(shù)變異分析），相對(duì)定量；
4. 檢測(cè)Fusion，可以檢測(cè)拷貝數(shù)，也可以檢測(cè)比率；

▏ 案例展示

 同樣的，科佰生物也針對(duì)這4個(gè)應(yīng)用開發(fā)對(duì)應(yīng)的檢測(cè)試劑盒，配套科佰生物的參考品，對(duì)試劑盒做性能評(píng)價(jià)，如下我們以EGFR T790M為例：
實(shí)驗(yàn)一：靈敏度測(cè)試

待測(cè)樣本：不同%AF的EGFR T790M的標(biāo)準(zhǔn)品，依次為5%，2%，1%，0.5%，0.2%，0.1%。

首先我們選擇50%的EGFR T790M標(biāo)準(zhǔn)品(CBP10402)，該標(biāo)準(zhǔn)品是通過基因編輯，二等位基因，CN=2，編輯一條為mutation，一條為WT，經(jīng)過理論值計(jì)算、Sanger測(cè)序、Bio-Rad DdPCR試劑盒（Assay ID: dHsaCP2000019）共同驗(yàn)證，確認(rèn)為50%的頻率。然后使用對(duì)應(yīng)的host cell的gDNA，按照質(zhì)量比（Qubit 3.0 三次定量取平均）有限稀釋到5%，2%，1%，0.5%，0.2%，0.1%，每個(gè)樣本準(zhǔn)備3個(gè)重復(fù)，合計(jì)18個(gè)樣本同一次實(shí)驗(yàn)檢測(cè)對(duì)應(yīng)的頻率。

對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)為：


由以上數(shù)據(jù)可見，EGFR T790M檢測(cè)體系，對(duì)于0.1%都是能檢出，且符合標(biāo)準(zhǔn)，但是波動(dòng)比較大。另外實(shí)驗(yàn)過程中，我們發(fā)現(xiàn)雖然DdPCR理論上可以生成20000個(gè)液滴，但是多次實(shí)驗(yàn)表明，實(shí)際生成往往是低于這個(gè)數(shù)值，平均約為8000-10000個(gè)，液滴數(shù)越少，因此低于0.1%的頻率可能會(huì)波動(dòng)很大，影響真實(shí)值判斷。

實(shí)驗(yàn)二：重復(fù)性測(cè)試

待測(cè)樣本：取1%和0.1%的EGFR T790M的標(biāo)準(zhǔn)品，分成8份，每份上樣10ng，一次實(shí)驗(yàn)完成對(duì)應(yīng)的定標(biāo)。

對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)為：



由以上數(shù)據(jù)可見，EGFR T790M檢測(cè)體系是穩(wěn)定可重復(fù)的，全部能檢出。

實(shí)驗(yàn)三 ：準(zhǔn)確性測(cè)試

待測(cè)樣本：取NGS驗(yàn)證為強(qiáng)陽、中陽、弱陽參考品合計(jì)10個(gè)，NGS驗(yàn)證為陰性參考品10個(gè)，實(shí)驗(yàn)檢測(cè)完成對(duì)應(yīng)的定標(biāo)

實(shí)驗(yàn)四：精密度測(cè)試

待測(cè)樣本：同一批號(hào)試劑盒對(duì)一份弱陽性參考品進(jìn)行10次重復(fù)檢測(cè)

由以上數(shù)據(jù)可見，結(jié)果均為T790M陽性，陽性符合率100%，突變頻率變異系數(shù)CV≤30%，符合預(yù)期


實(shí)驗(yàn)五：檢出限測(cè)試

待測(cè)樣本：檢測(cè)LOD標(biāo)準(zhǔn)品，重復(fù)20次， 由以上數(shù)據(jù)可見，陽性符合率≥95%，代表該濃度為試劑盒檢出限。


同樣的我們也對(duì)Gene Expression(mRNA)、CNV和Fusion開發(fā)了部分DdPCR試劑盒，利用科佰特有的標(biāo)準(zhǔn)品產(chǎn)品，我們做了性能評(píng)價(jià)，陸續(xù)上線了多款產(chǎn)品。

更多的DdPCR產(chǎn)品可以選擇科佰生物開發(fā)定制，我們不僅可以開發(fā)定制探針、引物，我們還有標(biāo)準(zhǔn)品用于驗(yàn)證體系性能評(píng)價(jià)。