▏ RNAi技術(shù)服務(wù)

近年來的研究表明，將與mRNA同源的正義RNA和反義RNA組成的雙鏈RNA（dsRNA）導(dǎo)入細(xì)胞，可以使mRNA發(fā)生特異性的降解，從而抑制其相應(yīng)基因的表達(dá)。這種轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制（Post-transcriptional gene silencing, PTGS）被稱為RNA干擾（RNAi）。由于RNAi具有高度的序列專一性，可以特異地使特定基因沉默，獲得功能喪失或降低突變，因此RNAi可以作為一種強(qiáng)有力的研究工具，用于功能基因組的研究。

科佰生物應(yīng)用國外知名公司的RNAi Designer平臺，可對靶基因序列進(jìn)行干擾位置效應(yīng)評價(jià)和序列同源型分析，完成siRNA/miRNA多種序列的的設(shè)計(jì)，并提供從siRNA合成、RNAi載體構(gòu)建到RNAi功能驗(yàn)證等全面的RNAi解決方案。

▏ siRNA合成服務(wù)

對于瞬時(shí)基因沉默實(shí)驗(yàn)，化學(xué)合成siRNA的方法操作簡便，容易獲得高水平的瞬時(shí)沉默效果，特異性強(qiáng)。我們通過嚴(yán)格設(shè)計(jì)來增強(qiáng)siRNA的專一性；針對某靶基因設(shè)計(jì)的3條siRNA可保證其中兩條的Knockdown效率達(dá)到75％（在轉(zhuǎn)染效率大于80％的情況下）。

在RNAi效應(yīng)階段，siRNA雙鏈結(jié)合一個(gè)核酶復(fù)合物從而形成所謂RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex，RISC）。激活的RISC通過堿基配對定位到同源mRNA轉(zhuǎn)錄本上，并在距離siRNA 3’端12個(gè)堿基的位置切割mRNA。

▏ siRNA合成實(shí)驗(yàn)流程

1）根據(jù)序列信息，進(jìn)行化學(xué)合成；
2）純化及定量；
3）凍干處理；
4）細(xì)胞轉(zhuǎn)染預(yù)實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件；
5）瞬時(shí)轉(zhuǎn)染或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染；
6）RT-PCR或Western blot檢測轉(zhuǎn)染后某一時(shí)間點(diǎn)靶基因的RNA水平或蛋白水平的變化。

▏ 質(zhì)量保證

針對某靶基因設(shè)計(jì)的3條siRNA可保證其中2條的Knockdown效率達(dá)到75％（在轉(zhuǎn)染效率大于80％的情況下）。

▏ shRNA構(gòu)建服務(wù)

構(gòu)建shRNA表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)shRNA在細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，能夠彌補(bǔ)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染持續(xù)時(shí)間短的不足。

▏ shRNA構(gòu)建實(shí)驗(yàn)流程

1）mRNA序列分析；
2）引物設(shè)計(jì)及合成；
3）單鏈互補(bǔ)引物退火；
4）將片段克隆至載體；
5）測序以確保插入序列正確性；
6）細(xì)胞轉(zhuǎn)染預(yù)實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件；
7）瞬時(shí)轉(zhuǎn)染或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染；
8）RT-PCR或Western blot檢測轉(zhuǎn)染后某一時(shí)間點(diǎn)靶基因的RNA水平或蛋白水平的變化。

▏ 質(zhì)量保證

針對某靶基因設(shè)計(jì)的3條shRNA序列，在轉(zhuǎn)染效率>80％的前提下，我們保證至少有1個(gè)克隆可以達(dá)到70％轉(zhuǎn)錄水平的沉默效率。

▏ miRNA構(gòu)建服務(wù)

RNAi載體利用細(xì)胞內(nèi)源性的miRNA加工機(jī)制，相比傳統(tǒng)shRNA載體可更高效地表達(dá)RNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)，并具有采用GFP進(jìn)行表達(dá)追蹤的優(yōu)點(diǎn)。每個(gè)基因設(shè)計(jì)的4條序列我們保證至少有2條可以達(dá)到至少70％轉(zhuǎn)錄水平的Knockdown效率（在轉(zhuǎn)染效率大于80％的情況下）。

▏ miRNA構(gòu)建實(shí)驗(yàn)流程

1）針對特定基因，設(shè)計(jì)miR RNAi序列，合成該序列并退火生成雙鏈DNA；
2）將DNA與載體連接并轉(zhuǎn)化；
3）測序驗(yàn)證miRNA序列的正確性；
4）細(xì)胞轉(zhuǎn)染預(yù)實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件；
5）瞬時(shí)轉(zhuǎn)染或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染；
6）RT-PCR或Western blot檢測轉(zhuǎn)染后某一時(shí)間點(diǎn)靶基因的RNA水平或蛋白水平的變化。

▏ 質(zhì)量保證

針對某靶基因設(shè)計(jì)的3條miRNA序列，在轉(zhuǎn)染效率>80％的前提下，我們保證至少有1個(gè)克隆可以達(dá)到70％轉(zhuǎn)錄水平的沉默效率。

▏ 客戶提供

1）目的基因的Accession Number（Human、Mouse或Rat種屬）以及技術(shù)要求（包括OD和nmols的精確數(shù)量、純化類型和修飾要求等）；

2）細(xì)胞株和詳細(xì)的細(xì)胞培養(yǎng)的操作步驟；

3）一抗（如果需要Western blot檢測）。

 

▏ 服務(wù)說明

1. RNAi技術(shù)服務(wù)不包括基因功能檢測，如需檢測，需要另外評估和收費(fèi)；
2. 客戶可以提供實(shí)驗(yàn)原材料，也可以查找本公司模板庫、載體庫、細(xì)胞庫，也可以由我們公司代購；