2019年12月05日國家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評中心發(fā)布最新一版《腫瘤相關(guān)突變基因檢測試劑（高通量測序法）性能評價通用注冊技術(shù)審查指導(dǎo)原則(2019年第83號)》  （以下簡稱“指導(dǎo)原則”），該指導(dǎo)原則是針對腫瘤相關(guān)基因檢測試劑分析性能評價的一般要求，性能評價主要思路是：提出產(chǎn)品性能有效性、安全性相關(guān)問題的假設(shè)，然后通過研究進行確認(rèn)。

參考品作為性能評價的主要原材料，可謂是非常重要，文中對此做了詳細的要求，今天我們就參考品做一些討論。

原文：
4. 參考品要求
內(nèi)部參考品是保證產(chǎn)品性能穩(wěn)定性以及檢測值可溯源的重要構(gòu)成之一。參考品研究應(yīng)包括原料選擇、制備過程、定值研究及評價指標(biāo)等。申請人應(yīng)對內(nèi)部陽性/陰性參考品的來源、基因序列設(shè)置等信息進行驗證，并提供參考品溯源過程的測量程序或參考方法的相關(guān)信息及詳細的驗證資料。

具體要求如下：
4.1陽性參考品及陽性質(zhì)控品：
4.1.1陽性參考品
理想狀態(tài)下，陽性參考品應(yīng)當(dāng)包括對所申報產(chǎn)品每個基因型的質(zhì)控樣本。但考慮到基于NGS技術(shù)的可檢測基因數(shù)量較多，申請人應(yīng)結(jié)合產(chǎn)品預(yù)期用途、臨床意義及基因類型等因素進行針對性和代表性的設(shè)計。
對于有明確腫瘤伴隨診斷相關(guān)的基因，應(yīng)考慮該類基因參考品設(shè)置的合理性和完整性，需包括伴隨診斷相關(guān)的全部熱點基因，建議采用臨床樣本或細胞系提取的核酸儲備液作為原料。
對于具有顯著臨床意義或潛在臨床意義的基因，應(yīng)考慮代表性問題，明確具有臨床診斷意義的基因類型及基因型中不同的變異類型。突變頻率、變異類型的選取應(yīng)具有代表性，包括不同外顯子，不同基因變異突變等。

如檢測編碼區(qū)較大且存在非熱點區(qū)域設(shè)計（如大于1M），建議在陽性參考品中考慮對檢測整體區(qū)域的靈敏度驗證（主要關(guān)注SNV等），如混合的永生化正常人白細胞DNA儲存液等。
不同突變/變異的變異豐度及突變頻率，濃度范圍設(shè)置應(yīng)具有代表性并提供這樣設(shè)定的依據(jù)。陽性參考品的突變形式及拷貝數(shù)需采用有效方法進行確認(rèn)，并明確接受標(biāo)準(zhǔn)。申請人在設(shè)計陽性參考品時可一并考慮檢測限參考品的設(shè)置及確認(rèn)方式，并提供相關(guān)的依據(jù)。
4.1.2陽性質(zhì)控品
模擬病人樣本的目標(biāo)核酸序列，并用于質(zhì)控整個檢測過程，包括核酸提取（如適用）、文庫構(gòu)建、測序和數(shù)據(jù)分析。目前陽性質(zhì)控檢測和分析過程應(yīng)與臨床樣本方式一致。
4.2陰性參考品及陰性質(zhì)控品
陰性參考品及陰性質(zhì)控品建議為正常臨床樣本的混合物或細胞系，應(yīng)明確不含有目標(biāo)區(qū)域腫瘤突變基因。
4.3精密度參考品
精密度參考品設(shè)置要求可參考陽性/陰性參考品。
4.4 PCR 試劑無模板質(zhì)控品（No Template Control，NTC）（如適用）
申請人應(yīng)根據(jù)申報產(chǎn)品特點設(shè)置NTC質(zhì)控品及檢測接受標(biāo)準(zhǔn)，監(jiān)測檢測過程中是否存在污染。

從原文中可以看出：
1.參考品是必須要的；
2.陽性參考品設(shè)置最為復(fù)雜，著重聚焦臨床意義的基因位點，不要求全覆蓋，同時要考慮靈敏度（最低檢出限LoD）設(shè)置，考慮到濃度梯度或突變梯度的不同，應(yīng)對各水平陽性參考品設(shè)置相應(yīng)檢出要求；
3.陽性質(zhì)控品應(yīng)該匹配整個檢測過程，檢測和分析應(yīng)該與臨床樣本一致，用于陽性、陰性的判斷；
4.陰性參考品和陰性質(zhì)控品可以為正常臨床樣本或者細胞系，可以兩者用同一個；
5.精密度參考品主要用于使用相同的樣本（包括檢測臨界值附近的樣本）在各種特定條件下進行檢測（如不同操作員，不同操作條件，不同檢測天數(shù)，不同儀器等），并考慮檢測中主要的變異來源，通過重復(fù)性檢測來評價性能；
6.NTC主要是用于分析特異性，評估產(chǎn)品僅可檢測到預(yù)期待測變異的能力。

綜上所述，對于參考品的設(shè)計，我們可以得出如下的表格（本設(shè)計僅代表小編個人意見）
 

按照這個思路，我們一步一步來設(shè)計一個完整的panel。
首先第一步是選擇基因位點，可以按照如下原則來設(shè)計：
1.如果是一個小panel，一般設(shè)計都是針對某一癌種，對應(yīng)的基因都是比較明確，位點能明確的盡量明確，不能明確的盡量涉及多種類型，比如SNV、Insertion、Deletion、Fusion、CNV，更細分的話，還有frameshift_variant、inframe_deletion、inframe_insertion、missense_variant、Splice_acceptor_Variant、Splice_Donor_Variant、Synonmymous_Variant等等。
因此對應(yīng)的參考品要求覆蓋全基因，位點也盡量全覆蓋，參考品信息可以在科佰生物官網(wǎng)查詢m.520jianting.com，如果沒有的位點，可以聯(lián)系科佰生物定制位點。
 

2.如果是一個大panel，對于參考品、檢測限、精密度，一般是不可能做到所有基因全覆蓋，并且固定的%AF和CN值的，因此按照《指導(dǎo)原則》的要求，我們應(yīng)該選擇具有臨床意義的基因和位點來表征，首當(dāng)其沖的就是NCCN指南提及的基因，另外再加一些臨床藥物研發(fā)的靶點和biomarker。其中需要特別注意的是由于NGS的探針原理，不能很好的分析出每一種fusion的斷點信息（DNA層面，內(nèi)含子斷點不唯一），因此建議大Panel選擇RNA作為fusion的檢測對象，同樣的也需要選擇RNA作為參考品。

對于大panel的陽性質(zhì)控品選擇，可以選擇泛腫瘤的質(zhì)控品：
 

如下列舉了常見的重要的基因位點信息，供大家參考，panel的參考品盤可以從中選取：
 

（部分截圖）

完整表單請點擊下載

有了選取的基因和位點，我們開始依次設(shè)計參考品、質(zhì)控品、檢測限和精密度，
1.陽性參考品盤

1.1根據(jù)目的選擇全盤的基因和位點，比如按照癌種設(shè)計；
1.2盡量覆蓋所有的基因和位點；
1.3盡量覆蓋SNV、indel、fusion和CNV；
1.4盡量多種突變細分類型，尤其可以考慮一些內(nèi)含子的剪切變異；
1.5Fusion可以選擇DNA和RNA；
1.6多個位點要拆包設(shè)計，不能把臨近甚至相同位點放在一個包里面；
1.7設(shè)計的每個包突變頻率或者CN值固定，這樣利于直接轉(zhuǎn)變?yōu)闄z測限標(biāo)準(zhǔn)品；
1.8不同包之間，盡量互補；
1.9一定要關(guān)注內(nèi)源突變的影響；
1.10如果能兼顧精密度、質(zhì)控盤的設(shè)計是最好的，這樣能一個包多種用途。
 

參考品盤設(shè)計好之后，就是實際落地去定制，這其中又涉及倍性、拷貝數(shù)的計算，還有最終檢測的QC標(biāo)準(zhǔn)，一般是選擇DdPCR定標(biāo)，這些工作可以交給科佰生物，我們可以按照客戶的要求定制符合標(biāo)準(zhǔn)的參考盤混合標(biāo)準(zhǔn)品。
 

同時科佰生物也推出了幾款現(xiàn)貨參考品盤，感興趣的朋友可以點擊表格查看：

 推薦陽性參考品盤：

2.檢測限參考品
檢測限參考品的設(shè)計比較簡單，只要將前面定制的參考品盤稀釋到待測的檢測限即可，至于下降到什么標(biāo)準(zhǔn)，依據(jù)平臺、待測樣本等因素而定，一般靈敏度是早篩>液體活檢>組織檢測。
 

3.精密度參考品
精密度參考品一般是用于看體系的重復(fù)性，因此取決于實驗室各項的變數(shù)多不多，對于單批次的參考品需要在不同條件下測試，同時不同批次的參考品也需要在不同條件下測試，尤其是LoD附近的檢測重復(fù)性。
因此如果能做到完全把參考品的全部包都能充分驗證精密度是最佳的，但是這樣的話確實成本、周期都比較長，折中的選擇是盡量選擇全部的基因，位點可以是一部分，選擇一個適中的突變頻率或者CN值，再選擇一個LoD附近的突變頻率或者CN值（當(dāng)然一般建立體系時還未知LoD的范圍，因此這個可以后期測試），來做精密度的性能評價。
 

4.陽性質(zhì)控品盤
陽性質(zhì)控品盤應(yīng)該匹配整個檢測過程，檢測和分析應(yīng)該與臨床樣本一致，用于陽性、陰性的判斷。
4.1可以選擇細胞沉淀、石蠟塊這樣的樣品形式，包含提取的過程；
4.2陽性質(zhì)控品使用頻率高，可以批量制備；
4.3陽性質(zhì)控品用于陽性判斷，因此只要包含所有的基因，不用所有的位點；
4.4陽性質(zhì)控品用于陽性判斷，出于容易檢出的目的，可以設(shè)計高一些的突變頻率和CN值。
 

科佰生物推出一款現(xiàn)貨陽性質(zhì)控品盤，包含基因多，突變種類齊全，可以點擊表格查看。

  推薦陽性質(zhì)控品盤：

針對大panel的陽性質(zhì)控品，可以考慮泛腫瘤大panel參考品。

5.陰性參考品
陰性參考品建議為正常組織或者細胞系，只要明確不含有目標(biāo)區(qū)域腫瘤突變基因即可。這里需要提醒的有四點：
5.1陰性參考品用量比較大；
5.2陰性參考品選擇容易制備，而且穩(wěn)定的樣品，穩(wěn)定是指穩(wěn)定供應(yīng)、基因組穩(wěn)定；
5.3陰性參考品的突變驗證盡量選擇深度高的NGS或者DdPCR；
5.4陰性參考品還要測對應(yīng)基因的CN值和倍性；

推薦陰性參考品：

 6.陰性質(zhì)控品
參照5. 陰性參考品
推薦陰性質(zhì)控品：

現(xiàn)在分子診斷技術(shù)日新月異，傳統(tǒng)的PCR、Q-PCR、AMRS-PCR、FISH，一直都被大量用于臨床診斷，到現(xiàn)在如日中天的NGS，越來越得到大家的認(rèn)可，再到下一代的三代測序，讀長長，周期短，便攜，未來預(yù)期美好。技術(shù)的革新給患者帶來新的希望，質(zhì)量保障是希望的前提，參考品盤是質(zhì)量檢測有力的工具。

我們呼吁業(yè)內(nèi)的每一家單位的每一個檢測，都能用上參考品，對我們每一份發(fā)出的數(shù)據(jù)都能負責(zé)。