Cellular cyclic AMP Detection KIT是一種競爭性的檢測技術，檢測細胞內(nèi)cAMP的量。藥物同貼壁細胞或者懸浮細胞共處理后，能通過此KIT檢測出藥物對細胞的作用。
 

      檢測原理采用TR-FRET檢測技術。細胞內(nèi)天然的cAMP同cAMP-Probe競爭性結合Eu -Anti-cAMP。最終檢測出來的信號與樣本中cAMP的濃度成反比。
 

      熒光比值665nm/620nm可以消除背景信號的干擾，意味著檢測不受實驗培養(yǎng)基條件（例如培養(yǎng)基、血清、生物素、有色化合物等）的影響。

1. 384淺孔板：Greiner#784075，PerkinElmer# Proxiplate 6008280，也可以應用于96孔板和1536微孔板。
 

2. 酶標儀：BMG  PHERAstar ，PerkinElmer Envision.
 

3. IBMX(Sigma#I5879-1G) 是最常用的磷酸二酯酶泛抑制劑，它能保證細胞中 cAMP 的高水平積累而不被降解。 
 

4. Foskolin(MCE#HY-15371) 可激活腺苷酸環(huán)化酶并增加細胞內(nèi) cAMP 水平，它可用作 Gs 應用的陽性對照。Forskolin也可以用作Gi 偶聯(lián)受體研究。

1. Stimulation Buffer :取1體積的Stimulation Buffer，加上4體積的ddH2O，稀釋5倍，1X的 Stimulation Buffer現(xiàn)配現(xiàn)用。
 

2.檢測試劑的配制：（1）cAMP-Probe (100X) 取1體積的cAMP-Probe，加上99體積的Lysis & Detection Buffer，稀釋100倍備用。（2）Eu -Anti-cAMP (100X)取1體積的Eu -Anti-cAMP，加上99體積的Lysis & Detection Buffer，稀釋20倍備用。
 

3. IBMX: 用DMSO配制IBMX的stock 溶液0.5M，常用的工作濃度是0.5mM，用1X的Stimulation Buffer稀釋1000倍，現(xiàn)配現(xiàn)用。
 

4. Forskolin: 用DMSO配制Forskolin的stock 溶液10mM，根據(jù)實驗需要，可以用1X的Stimulation Buffer稀釋成不同的濃度備用。

      測試標準品的反應曲線，以確定實驗室中Stimulation Buffer或者細胞培養(yǎng)基的檢測線性動態(tài)范圍。這還將驗證實驗中是否產(chǎn)生了預期的 S/B 和 cAMP的IC50值。
 

      特別是IC10 和 IC90的數(shù)值將在實驗中非常有用，可以用于優(yōu)化細胞系的細胞密度。
 

      測試標準品的反應曲線，以確定實驗室中Stimulation Buffer或者細胞培養(yǎng)基的檢測線性動態(tài)范圍。這還將驗證實驗中是否產(chǎn)生了預期的 S/B 和 cAMP的IC50值。
 

      特別是IC10 和 IC90的數(shù)值將在實驗中非常有用，可以用于優(yōu)化細胞系的細胞密度。
 

計算每個孔的受體和供體發(fā)射信號的比例

Ratio=665nm的信號值/620nm的信號值, 四參數(shù)擬合曲線如下圖
 

1. 必須優(yōu)化各種細胞參數(shù)，這些參數(shù)取決于要篩選的化合物的類型（激動劑或拮抗劑）以及要篩選的GPCR 的G 蛋白類型（Gs或 Gi）。這些參數(shù)包括細胞密度、IBMX 濃度、激動劑濃度（用于拮抗劑篩選）和藥物刺激時間。
 

2. 必須優(yōu)化細胞密度，以確保刺激細胞的 cAMP 水平在測定的線性動態(tài)范圍內(nèi)（IC10 至 IC90）。如果結果超出測定的線性范圍，數(shù)據(jù)將不準確。
 

3.化合物建議在1X的Stimulation Buffer 中稀釋，對于超過 2 小時的刺激時間，化合物可以在細胞培養(yǎng)基中稀釋。

計算每個孔的受體和供體發(fā)射信號的比例

Ratio=665nm的信號值/620nm的信號值